由于具有一些固有特性,例如與人體組織的生物相容性,硅橡膠通常被用于醫療設備。雖然硅橡膠本身相對呈惰性,但在使用設備期間,有機營(yíng)養物可能吸附到硅橡膠表面,并形成生物膜。許多含有硅橡膠的設備暴露于適合生物膜生長(cháng)的恰當濕氣、營(yíng)養物、時(shí)間和溫度條件,包括移植、導管、靜脈注射連接器以及用于呼吸治療的管道。隨著(zhù)接觸時(shí)間的增加以及沒(méi)有成功進(jìn)行干預,產(chǎn)生微生物的生物膜會(huì )造成感染。
一、銀基硅橡膠抗菌劑
抗菌劑處理的生物相容性是需要考慮的最重要問(wèn)題之一。細胞毒性是最敏感的生物相容性試驗;經(jīng)過(guò)處理的設備或設備濃縮劑直接暴露于哺乳動(dòng)物細胞培養的細菌。銀基抗菌劑會(huì )在這些體外試驗中引起一些細胞毒性效應,但是,在嚴格的研究和對組織、整個(gè)動(dòng)物和人體開(kāi)展的觀(guān)察中,則展現出很少的生物相容性問(wèn)題或者沒(méi)有生物相容性問(wèn)題。在提交醫療設備進(jìn)行的評審中,美國食品和藥品管理局(FDA)和其它管理機構檢查整套數據,以確定設備是否生物相容。由于銀基抗菌劑用于傷口處理和其它應用的歷史較長(cháng),管理機構和保健提供商對銀具有一定的熟悉程度,而這種熟悉程度對于其它抗菌劑可能是沒(méi)有的。為此,銀是目前為止用于抗菌醫療設備的最常見(jiàn)抗菌劑。
在集成于聚合物、樹(shù)脂或涂層之后,存在已經(jīng)加工銀釋放銀離子的幾種不同配方。不管銀技術(shù)是否基于銀金屬(AG0)、銀鹽(例如AgCl)或離子銀(Ag+)或者銀離子的其它多價(jià)產(chǎn)品,產(chǎn)品必須最終釋放離子銀以成為一種有效的抗菌劑。銀金屬(Ag0)沒(méi)有抗菌活動(dòng),必須進(jìn)行氧化,以形成最終可以釋放離子銀的產(chǎn)品。這一系列研究中描述的銀基技術(shù)是一種稱(chēng)為SelectSilverSR12(SSSR12)的配方,將銀離子(Ag+)包在微微溶解的玻璃微粒內。SSSR12抗菌劑通過(guò)溶解機制從基于玻璃的無(wú)機矩陣緩慢釋放銀離子。當周?chē)h(huán)境(體液、靜脈注射液等)接觸微粒時(shí),矩陣緩慢溶解,從而釋放銀離子。表面釋放銀離子的速度緩慢,但是足以快到在基底上面和附近維持有效的濃度。
在銀離子離開(kāi)經(jīng)過(guò)SSSR12處理的材料表面時(shí),會(huì )由于與相鄰水成環(huán)境中存在的蛋白質(zhì)、鹽或其它基底發(fā)生非特定交互作用而不活躍(圖2)。這類(lèi)交互作用以各種形式的銀離子釋放技術(shù)出現。當未粘附的銀離子到達微生物表面時(shí),抗菌的作用機制開(kāi)始。微生物細胞攝取銀離子的機制有幾種,包括將銀離子擴散到細胞內以及使用通常傳輸基本離子的系統進(jìn)行主動(dòng)傳輸。雖然Ag+會(huì )采用非特定的方式粘附到細胞表面并造成細胞膜功能中斷,但是,人們廣泛認為,Ag+的抗菌特性依賴(lài)于與細胞內的現場(chǎng)交互作用。進(jìn)入細胞之后,銀離子開(kāi)始中斷微生物的重要功能。銀離子的反應性高,隨時(shí)準備粘附到含有硫、氧和氮的給電子體官能團上以及磷酸鹽和氯化物等負電荷官能團上。銀離子的主要分子目標駐留于細胞硫醇(-SH)官能團內,通常發(fā)現位于稱(chēng)為酶的重要蛋白質(zhì)中。酶會(huì )變性,因為存在由于A(yíng)g+粘附而造成的構象變化。生成細胞能源時(shí)需要Ag+變性的許多酶。如果充分中斷微生物細胞生成能源的能力,則微生物將快速死亡。
二、銀釋放動(dòng)力
在室溫中將經(jīng)過(guò)處理的樣品暴露于鹽水(0.85%NaCl)24小時(shí)并緩慢攪拌,以測量樣品釋放的生物藥效利用銀。使用5%的硝酸將提取物酸化并使用ICP-OES(PerkinElmer,型號:Optima4300DV)測量銀的含量(ppb)。要清除雜質(zhì),在酸化和分析之前,使用0.2微米的過(guò)濾器過(guò)濾所有樣品。
三、使用“頂部接觸”化驗確定效力
使用簡(jiǎn)單的化驗評估帶有和不帶SSSR12的體外設備的LSR元件的效力。分散103、104或105抵抗甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC(美國模式培養物集存庫)#43300(MRSA)或克雷白氏肺炎桿菌ATCC(美國模式培養物集存庫)#4352細胞之后,立即將元件尖部接觸營(yíng)養瓊脂板的表面,以接種樣品。然后將接種的樣品置于消毒盤(pán)內,并將在潮濕條件下在30℃孵化24小時(shí)。孵化之后,使元件重復接觸消毒營(yíng)養瓊脂板的表面(10次)。另外在37℃再孵化營(yíng)養瓊脂板24小時(shí)。如果存活細胞在暴露于LSR元件最初24小時(shí)暴露時(shí)期時(shí)存活并轉移到瓊脂表面,則細胞可以在瓊脂表面的接觸部位生長(cháng)和形成群體。采用導致成功轉移存活細胞的接觸數量以及觀(guān)察每一接觸點(diǎn)的生長(cháng)量表示結果。
通過(guò)模注制備LSR樣品塊,以制備三種不同含量的SSSR12抗菌劑劑量。開(kāi)展X射線(xiàn)熒光光譜試驗,以確定水平樣品塊中銀的含量。雖然這一特別研究中只有三個(gè)數據點(diǎn),但是,在銀含量和目標劑量之間存在密切的關(guān)系(R2=0.994)(圖3)。另外還在壓縮模注樣品塊上開(kāi)展了這一研究,結果相似(未顯示數據)。如果抗菌劑或抗菌劑載體含有相當獨特的信號元素,還采用XRF檢測其它抗菌劑。同時(shí),XRF技術(shù)是一種無(wú)損技術(shù),可以用于制造或品質(zhì)保證實(shí)驗室環(huán)境的在線(xiàn)測量。
12小時(shí)的時(shí)間使銀離子達到平衡水平(本研究中為ca.500ppb)。緩慢釋放銀離子是通過(guò)多日使用保護表面所需要的釋放動(dòng)力的一部分。另外,銀離子達到有效水平的時(shí)間框架符合形成生物膜需要的時(shí)間。
采用兩種不同劑量SSSR12處理的LSR通過(guò)重復暴露于鹽水展示出緩釋銀離子(圖5)。在單次暴露于鹽水24小時(shí)之后,劑量反應較為明顯。但是,在暴露于鹽水兩天之后,從兩種樣品中釋放的離子似乎達到大約400ppb的平衡。至少連續七天暴露于新鮮鹽水,釋放的銀維持在ca.400-450ppb。
在我們的實(shí)驗室中已經(jīng)觀(guān)察到這種平衡現象多次,是由與相同溶液中存在的Ag、Cl和Na相關(guān)的共同離子效應造成的。這種平衡有效抑制了銀的釋放,直至銀離子被清除(例如沖洗清除)或者粘附到細菌或其它有機物上面。解除平衡壓力之后,再次釋放銀離子。并非所有銀基抗菌劑都能展現采用SSSR12觀(guān)察到的銀釋放動(dòng)力。另一種銀基技術(shù)已經(jīng)用于LSR。將模注樣品塊暴露于鹽水并采用前面所述的相同類(lèi)型化驗測量銀的釋放。結果表明最初釋放的速率相對較高,之后在暴露于鹽水兩天之后急劇下降(圖6)。暴露三天之后的釋放速率變得穩定,但是釋放的銀離子濃度低(<30ppb)。進(jìn)一步分析表明,LSR表面的大多數銀微粒被一薄層硅橡膠蓋住,降低了濕氣到達銀微粒的能力,因此釋放銀離子的濃度降低。使用相同方法評估的其它銀基技術(shù)研究結果表明,大多數存在相同的問(wèn)題。
在暴露于革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽(yáng)性細菌的代表種類(lèi)24小時(shí)之后,評估了采用不同劑量的SSSR12處理的LSR的噴射模注樣品塊的抗菌性能。在暴露于鹽水之前以及暴露于鹽水3天和7天之后,試驗了經(jīng)過(guò)處理的LSR樣品。本研究中,作為一種樣品試驗了未經(jīng)處理的LSR。將在37℃暴露于未經(jīng)處理的聚丙烯樣品塊24小時(shí)之后恢復的存活細胞數量與從未經(jīng)處理和經(jīng)過(guò)處理的LSR產(chǎn)品恢復的細胞數量進(jìn)行比較。與未經(jīng)處理的聚丙烯相比,暴露于未經(jīng)處理的LSR的兩種種類(lèi)的數量微微降低(ca.0.6對數單位)。對于革蘭氏陰性細菌克雷白氏肺炎桿菌,采用SSSR12處理的LSR的所有樣品展示出最大的對數降低(經(jīng)過(guò)處理的產(chǎn)品上沒(méi)有恢復的存活細胞)。對于金黃色葡萄球菌,觀(guān)察到明顯的劑量反應,SR12的含量越高,則對數降低越高。觀(guān)察了以前沒(méi)有暴露于鹽水的樣品以及以前暴露于鹽水3天和7天的樣品的劑量反應。對于以前暴露于鹽水的樣品,在給定SSSR12劑量之內,效力保持恒定或微微增加。
采用SSSR12處理的LSR展現了在重復暴露于鹽水時(shí)抵抗兩種微生物的持續效力,與動(dòng)力研究中所看到的銀緩釋相符。雖然本研究中沒(méi)有討論這一主題,但是應注意到,銀抵抗細菌比抵抗真菌更有效。同樣,銀離子很難滲透人體細胞的細胞壁和多細胞膜,銀離子不能很好滲入真菌等更復雜微生物的細胞之內??梢允褂米銐虻你y處理醫療設備,以展示抵抗白假絲酵母菌等真菌的效力,但是,要求的劑量高于控制細菌生長(cháng)的劑量。在后期固化采用5%和10%SSSR12抗菌劑處理的LSR之前和之后,對噴射模注樣品塊開(kāi)展了相似研究。表明,與未經(jīng)處理的聚丙烯相比,未經(jīng)處理的LSR展示出微小但是一致的效力。在暴露于鹽水之前以及暴露于鹽水7天之后試驗時(shí),經(jīng)過(guò)處理的LSR樣品展示出抵抗兩種試驗微生物的效力更高。所有樣品的對數降低量處于或接近最大值。在5%的劑量暴露于鹽水7天之后,效力微微下降。后期固化對于抗菌性能沒(méi)有可以測量的影響。需要開(kāi)展可以確定暴露于經(jīng)過(guò)處理的表面之后存活細胞的實(shí)際降低數量的化驗,以量化抗菌效力。要求提供此類(lèi)數據,以在美國和歐洲注冊經(jīng)過(guò)抗菌處理的醫療設備。但是,還有其它技術(shù)可以用于快速篩查許多樣品以及提供可視的效力顯示。使用了微生物學(xué)中用于檢測主動(dòng)呼吸細胞的一種常見(jiàn)染料(TTC)修改上面所述用于測量存活細胞對數降低的薄膜接觸法。將未經(jīng)處理的聚丙烯樣品、未經(jīng)處理的LSR樣品以及采用1.5%和5%SSSR12抗菌劑處理的LSR樣品在37℃暴露于克雷白氏肺炎桿菌細胞中24小時(shí)。暴露之后,將樣品置于TTC瓊脂板的表面。在37℃孵化另外24小時(shí)之后,由于瓊脂板表面生長(cháng)細菌而形成紅色,因此可以觀(guān)察到存活細胞(圖7)。保留在未經(jīng)處理的聚丙烯和LSR上的存活細胞展示出在TTC瓊脂板上廣泛生長(cháng)。對比之下,在采用1.5%SSSR12處理的樣品上只檢測到少量存活細胞。在采用5%SR12處理的樣品上沒(méi)有檢測到存活細胞。
可以提供有意義數據的另一種化驗結果以及效力的可視圖形參見(jiàn)圖8。采用10%SSSR12處理的LSR被模注進(jìn)體外設備的硅樹(shù)脂元件中。元件太小,不能開(kāi)展前面所述的標準薄膜接觸法試驗,因此開(kāi)發(fā)了一種新的方法。該方法測量接種元件可以將存活細胞傳輸到營(yíng)養瓊脂板上多少次(共10次)。在接種體水平(103細胞)較低時(shí),在MRSA的存活細胞未傳輸到瓊脂之前,未經(jīng)處理的元件樣品在十次中有七次接觸瓊脂表面。在接種體水平(104-105細胞)較高時(shí),細胞至少通過(guò)10連續接觸傳輸到瓊脂表面。對于經(jīng)過(guò)處理的LSR元件,成功傳輸到瓊脂表面的次數更低。每次接觸傳輸到瓊脂板的細胞數量也似乎更少。這些數據表明,經(jīng)過(guò)處理的元件表面的存活細胞比未經(jīng)處理的元件表面的存活細胞少。在其它研究中觀(guān)察到,抵抗克雷白氏肺炎桿菌的效力高于抵抗金黃色葡萄球菌的效力(附表)。另一種基于銀的產(chǎn)品也展現出在抵抗克雷白氏肺炎桿菌方面效力極好,但是,在抵抗金黃色葡萄球菌的效力方面沒(méi)有采用SSSR12處理的樣品樣品有效。接種體水平也影響經(jīng)過(guò)處理的LSR的效力,因為在較低接種體水平時(shí),出現的細菌轉移更少。另外,還在以前暴露于鹽水三天和七天的LSR元件上開(kāi)展了這種化驗。如前所述,采用SR12處理的LSR的效力似乎在材料暴露于鹽水時(shí)增加。這些結果表明,SSSR12能夠在醫療設備實(shí)際元件的預期使用時(shí)間展示出效力。要求開(kāi)展進(jìn)一步研究以了解通過(guò)較長(cháng)時(shí)期暴露以及在不同環(huán)境條件下的抗菌性能水平。
通過(guò)將抗菌劑集成于設備元件內部或涂層設備而采用抗菌素處理醫療設備,已經(jīng)證實(shí)可以幫助降低與設備相關(guān)的感染,但是只是少數情況。存在使用可以展現出生物相容性要求水平和持續效力水平的現有成份開(kāi)發(fā)新的抗菌劑或新技術(shù)的機會(huì )。由于存在這些要求,銀基抗菌素仍然是集成于醫療設備內部或表面的最常見(jiàn)和最可靠的抗菌劑。
四、硅橡膠中抗菌劑的評估
如果生物相容性試驗的結果表明抗菌劑處理對于其用途安全,則其它關(guān)鍵方面是處理的有效性?;阢y的處理的抗菌效力評估遵循始于確定經(jīng)過(guò)處理的材料內部或上面的劑量的試驗計劃。對于熱塑性塑料,用于確定銀劑量的方法涉及將樣品加熱到極高溫度,以揮發(fā)和燒毀所有有機材料,然后用酸溶解灰燼,以溶解和釋放銀離子。確定溶解溶液中銀離子濃度的最常用方法是原子吸收光譜(AAS)或電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)。但是,眾所周知,很難采用化學(xué)方法溶解硅橡膠。確定經(jīng)過(guò)處理的硅橡膠中銀含量的另一種方法是采用X射線(xiàn)熒光光譜法(XRF)。這種方法利用了銀的唯一X光信號的優(yōu)點(diǎn)。該方法生成“X射線(xiàn)量”方面的結果,只提供相對的銀劑量。量化銀的數量要求建立已知銀濃度對比X射線(xiàn)量的一根標準曲線(xiàn)。知道已經(jīng)達到材料中銀抗菌劑的目標劑量之后,需要了解銀釋放的動(dòng)力。必須從表面釋放銀且能夠進(jìn)入微生物的細胞,以達到最大效力。最常見(jiàn)的方式是,釋放銀的形式是銀離子Ag+。一般來(lái)說(shuō),將經(jīng)過(guò)處理的材料暴露于模仿最終應用的溶液。然后使用AAS或ICPOES測量洗提液中的銀離子濃度。通常修改暴露場(chǎng)景,以符合預期體積與表面面積的比率以及成品醫療設備的暴露持續時(shí)間。例如,基于硅橡膠的導尿管會(huì )每天暴露于人工尿或鹽水新鮮溶液,時(shí)間長(cháng)達連續30天。這些試驗可以幫助了解銀基抗菌劑技術(shù)是否相容硅橡膠矩陣,是否有能力持續受控地釋放銀離子,以及硅橡膠是否加載足量的抗菌劑,以釋放銀離子達到預期的使用持續時(shí)間。
最后篩查經(jīng)過(guò)處理的材料抵抗微生物的效力。通常分級開(kāi)展抗菌劑的效力試驗。首先,將經(jīng)過(guò)處理和未經(jīng)處理的硅橡膠樣品暴露于微生物24小時(shí),并確定存活微生物細胞的降低量。如果最初篩查試驗顯示積極結果,則修改效力試驗參數以更好模擬設備的預期使用條件以及相關(guān)目標微生物。在確定銀釋放動(dòng)力時(shí),效力方法涉及修改接觸經(jīng)過(guò)處理的材料的溶液、體積與表面面積比率以及接觸的持續時(shí)間。在本文總述的研究中,檢查了基于銀的幾個(gè)不同抗菌劑,以確定其用于醫療設備的LSR的處理性能。
五、使用薄膜接觸篩查法確定效力
使用“薄膜接觸法”評估抵抗細菌的效力,這是“ISO22916:塑料-塑料表面抗菌劑活動(dòng)測量”的一種修改方法。將樣品塊置于經(jīng)過(guò)消毒的培養皿內并用異丙醇擦拭,以便進(jìn)行清潔。然后將樣品暴露于懸浮在采用0.2%營(yíng)養肉湯補充的0.85%NaCl(鹽水)中的細菌(0.4毫升,每毫升105個(gè)細胞)。采用聚乙烯薄膜蓋住細菌懸浮液,以將接種體擴散到樣品表面并防止干燥。在37℃孵化24小時(shí)之后,用10毫升中和溶液清洗樣品,以清除粘附的細胞和非活性殘留銀離子。使用基于微濃度測定板的“最可能數量”化驗量化中和溶液中存活細胞的數量。將每個(gè)樣品的細胞數量轉換為對數單位后,基于從未經(jīng)過(guò)處理的聚丙烯回收的細胞數量計算暴露于LSR之后細胞的對數降低數量(對數降低數量=對數(細胞/聚丙烯樣品)-對數(細胞/LSR樣品)。未經(jīng)處理的聚丙烯用作內部對照樣品,因為以前的許多試驗已經(jīng)表明這種材料在引起細胞數量增加或減少方面呈惰性。最大對數降低數量代表效力最高,可以采用特別的研究測量。使用克雷白氏肺炎桿菌ATCC(美國模式培養物集存庫)#4352和金黃色葡萄球菌ATCC(美模式培養物集存庫)#6538試驗復制樣品。
六、用于硅橡膠的抗菌劑
將抗菌劑集成于醫療設備內部或表面是一種降低微生物聚積在醫療設備表面并形成生物膜的可行戰略。經(jīng)過(guò)抗菌劑處理的醫療設備多種多樣,包括導管、魯爾設備、氣管導管以及傷口敷料。少數情況下,使用抗菌劑設備不僅已經(jīng)顯示可以殺滅設備表面的微生物,而且還可降低感染率。
實(shí)驗
采用各種方法制備LSR樣品,包括混合抗菌劑與LSR元件或者通過(guò)第三種流量擴散添加抗菌劑。采用壓縮或注射模注樣品塊或實(shí)際設備元件。
七、使用TTC瓊脂化驗確定效力
使用上面所述的薄膜接觸法評估抗菌的效力。將帶有微生物的樣品在37℃孵化22小時(shí)之后,從樣品上取下接種體,將樣品倒置放在采用0.01%三苯基氯化四氮唑(TTC)補充的胰蛋白大豆瓊脂板上。TTC是一種無(wú)色化合物,采用主動(dòng)呼吸細菌會(huì )還原為不能溶解的紅色。將TTC集成于營(yíng)養瓊脂板內,然后將暴露于微生物的樣品置于板的表面,可以根據瓊脂表面存在的紅色檢測任何存活的細菌。孵化瓊脂板24小時(shí)并觀(guān)察粘附在材料表面的存活細胞形成的紅色區域。
八、硅橡膠中銀基抗菌劑劑量的確定
使用X射線(xiàn)熒光光譜(XRF;ThermoNoranQuanXEC公司,型號:C10014)確定樣品中不同元素的含量估計值。XRF分析產(chǎn)生以“單位”為術(shù)語(yǔ)的元素濃度;單位越高,元素的濃度越高。但是,單位依賴(lài)于樣品幾何形狀的程度極大,因此很難比較不同幾何形狀或配置的樣品的單位。在繪制圖形和分析之前,要減除背景單位。